జర్నల్ ఆఫ్ కార్సినోజెనిసిస్ & మ్యూటాజెనిసిస్

నైరూప్య

DNA స్ట్రాండ్ బ్రేక్ అసోసియేటెడ్ బైస్టాండర్ ఎఫెక్ట్ (DSB-ABE)ని లెక్కించడానికి E18 సెల్ మోడల్‌ని ఉపయోగించడం

జలాల్ నాసిర్

లింఫోబ్లాస్ట్ సెల్ లైన్ E18 అనేది TK6 యొక్క ఉత్పన్నం మరియు హెటెరోజైగస్ TK1 / tk1 జన్యువు యొక్క ఇంట్రాన్ 2లో I-Sce1 ఇన్సర్ట్‌ను కలిగి ఉంది . రేడియేషన్ స్వతంత్ర DNA నష్టం మరియు సంబంధిత ప్రేక్షకుల ప్రభావాన్ని కొలవడానికి I-Sce1 సైట్‌లో డబుల్ స్ట్రాండ్ బ్రేక్‌లను ప్రేరేపించడానికి I-Sce1 పరిమితి ఎండోన్యూకలీస్‌తో E18ని లక్ష్యంగా చేసుకోవచ్చు. E18 సెల్ లైన్ నిర్మాణం కోసం ఒక Eco47III సైట్ pTK-UAS లీనియరైజ్డ్ ప్లాస్మిడ్ వెన్నెముకలోకి చొప్పించబడింది మరియు DNA లిగేస్ సమక్షంలో ISce1 పరిమితి శ్రేణి యొక్క మొద్దుబారిన ఒలిగోన్యూక్లియోటైడ్‌లతో ఎనియల్ చేయబడింది. DH5-α కణాలు pTK-UAS-Eco47III-Sce1తో కణాలను వేడి బదిలీ చేయడం ద్వారా మరియు యాంపిసిలిన్ రెసిస్టెంట్ కాలనీలను ఎంచుకోవడం ద్వారా రూపాంతరం చెందాయి. Eco47III మరియు I-Sce1 సైట్‌ల ఉనికి కోసం ప్లాస్మిడ్ DNA సంగ్రహించబడింది మరియు విశ్లేషించబడింది. థైమిడిన్ కినేస్ యాక్టివ్ యుగ్మ వికల్పం యొక్క ఇంట్రాన్ 2లో I-Sce సైట్‌తో కూడిన క్లోన్ తదుపరి ప్రయోగం కోసం ఎంపిక చేయబడింది మరియు దీనికి E18 అని పేరు పెట్టారు. డబుల్ స్ట్రాండ్ బ్రేక్ ప్రేరిత ఉత్పరివర్తనాలను ప్రదర్శించడానికి ఈ మోడల్ పరీక్షించబడింది మరియు ఈ స్ట్రాండ్ బ్రేక్‌లు అమాయక కణాలలో పెరిగిన మ్యుటేషన్ ఫ్రీక్వెన్సీ ద్వారా కొలవబడిన DNA స్ట్రాండ్ బ్రేక్ అసోసియేట్ బైస్టాండర్ ఎఫెక్ట్ (DSB-ABE) ను కూడా ఉత్పత్తి చేయగలవు. I-Sce1 పరిమితి ఎండోన్యూకలీస్‌ను వ్యక్తీకరించడానికి GFP మార్కర్‌ను మోస్తున్న ప్లాస్మిడ్ pAdTrackCMV I-Sce1 E18 కణాలలో ఎలక్ట్రోపోరేట్ చేయబడింది, ఇది సక్రియ TK యుగ్మ వికల్పం యొక్క ఇంట్రాన్ 2 వద్ద I-Sce1 సైట్‌ను ప్రత్యేకంగా లక్ష్యంగా చేసుకుంటుంది. pAdTrackCMV I-Sce1 ద్వారా ఎక్సోజనస్ I-Sce1 వ్యక్తీకరణతో E18ని లక్ష్యంగా చేసుకునే ముగింపు పాయింట్‌గా బైస్టాండర్ మ్యుటేషన్ ఫ్రాక్షన్ (BMF)ని కొలవడానికి ప్రత్యక్ష మ్యుటేషన్ భిన్నం (DMF) లేదా కండిషన్డ్ మీడియం ట్రాన్స్‌ఫర్‌తో పాటు అమాయక కణాలకు మ్యుటేషన్ ఫ్రాక్షన్ అస్సే ఉపయోగించబడింది. DNA నష్టాన్ని ప్రేరేపించడానికి మరియు DMF మరియు BMFలను లెక్కించడానికి.