జర్నల్ ఆఫ్ న్యూట్రిషనల్ డిజార్డర్స్ & థెరపీ

నైరూప్య

క్లినికల్ న్యూట్రిషన్ 2019: ఎలుకలలో పేగు సమగ్రతపై కొంబుచా టీ ప్రభావాలు- ఎలాహెహ్ మహమూదీ- అల్బోర్జ్ యూనివర్శిటీ ఆఫ్ మెడికల్ సైన్సెస్

ఎలాహ్ మహమూదీ

ఆబ్జెక్టివ్(లు): ఆక్సీకరణ ఒత్తిడి అనేది హైపర్‌పీసియా యొక్క రోగనిర్ధారణలో చిక్కుకుంది, ఇది హృదయ సంబంధ వ్యాధులు మరియు మరణాలకు ప్రమాద కారకం. టొమాటో కెరోటినాయిడ్స్ మానవ ఆరోగ్యం యొక్క వివిధ అంశాలను ప్రభావితం చేస్తాయని అనేక మానవ అధ్యయనాలు చూపించాయి. ఈ ప్రదర్శన సమయంలో రచయిత రెండు సమస్యలను పరిష్కరిస్తారు ??? ఎ) UV వికిరణానికి చర్మ కణాల ప్రతిస్పందనను సమతుల్యం చేయడం మరియు బి) ఎలివేటెడ్ కీలక గుర్తును తగ్గించడం. ఎ) టొమాటో కెరోటినాయిడ్స్ ఎరిథీమాను తగ్గించడం ద్వారా మరియు కొల్లాజెన్ ఉత్పత్తి మరియు విచ్ఛిన్నం మధ్య సమతుల్యతను మెరుగుపరచడం ద్వారా UV-ప్రేరిత నష్టాన్ని తగ్గించగలవని అనేక మానవ అధ్యయనాలు చూపించాయి. పాలీఫెనాల్స్‌తో పాటు టొమాటో కెరోటినాయిడ్‌ల మిశ్రమం వాటి చర్య యొక్క సమ్మషన్ నుండి ఊహించిన దాని కంటే మెరుగైన చర్మ రక్షణను ఇస్తుందని మేము ఊహించాము. నిజమే, రోజ్మేరీ ఎక్స్‌ట్రాక్ట్ (పాలీఫెనాల్ కార్నోసిక్ యాసిడ్ కలిగి)తో టొమాటో న్యూట్రీయంట్ కాంప్లెక్స్ (లైకోపీన్ కలిగిన) మిశ్రమాలు సినర్జిస్టిక్‌గా ఇన్‌ఫ్లమేటరీ మార్కర్‌లను తగ్గించి, చర్మ కణాలలో యాంటీ ఆక్సిడెంట్ యాక్టివిటీని ప్రేరేపించి మ్యాట్రిక్స్ మెటాలోప్రొటీనేస్ (MMPs) తగ్గడానికి మరియు తద్వారా కొల్లాజెన్ విచ్ఛిన్నతను తగ్గించవచ్చని మేము అర్థం చేసుకున్నాము. మరియు చర్మం వృద్ధాప్యాన్ని ఆలస్యం చేస్తుంది. బి) హైపర్‌పీసియా హృదయ సంబంధ వ్యాధులు మరియు మరణాలకు ప్రమాద కారకంగా ఉండవచ్చు. హైపర్‌టెన్సివ్ వ్యక్తులలో సాధారణ చిహ్నాన్ని నిర్వహించడంలో టమోటా పోషక కాంప్లెక్స్ సప్లిమెంట్ యొక్క సరైన ప్రభావవంతమైన మోతాదును వెలికితీసేందుకు మేము డోస్-రెస్పాన్స్ విశ్లేషణ చేసాము. మెటీరియల్స్ మరియు పద్ధతులు:

ఏడు రోజుల పాటు పానీయంలో డెక్స్ట్రాన్ సోడియం సల్ఫేట్‌ని ఉపయోగించి యువకులు మరియు యుక్తవయస్సులోని రెండు సేకరణలలో జల్లెడ లాంటి గట్ ఒప్పించబడింది. గతంలో, fKT పెద్దప్రేగు శోథ ద్వారా ఆడంబరమైన ఎలుకలకు నిర్వహించబడుతుంది మరియు పెద్దప్రేగు శోథతో వయస్సు-సరిపోలిన సాధారణ మరియు చికిత్స చేయని జంతువులకు సంబంధించినది.

కొంబుచా టీ (KT) తయారీ

బ్లాక్ టీ (గోలెస్తాన్, టెహ్రాన్, ఇరాన్) వేడినీటిలో (1.2%w/v) కలుపుతారు మరియు 10 నిమిషాలు కాయడానికి వదిలివేయబడింది. టీని శుభ్రమైన జల్లెడ ద్వారా ఫిల్టర్ చేసి, టీలో సుక్రోజ్ (10%) కరిగించబడుతుంది. KTని నిర్వహించడానికి, చల్లబడిన టీలో 200 ml గతంలో పులియబెట్టిన 3%w/v టీ ఫంగస్‌తో పాటు 10%v/v KT ద్రవంతో టీకాలు వేయబడింది. 14 రోజుల పాటు 28 °C వద్ద పొదిగించడం ద్వారా సేకరణను పులియబెట్టడానికి వదిలివేయబడింది. ఫిల్టర్ చేయబడిన KT (fKT)ని రూపొందించడానికి, ఫలితంగా పులియబెట్టిన టీ 20 నిమిషాలకు 5000 rpm వద్ద సెంట్రిఫ్యూజ్ చేయబడింది మరియు గాలి పంప్‌తో కూడిన 0.45 µm సెల్యులోజ్ ఫిల్టర్‌ను ఉపయోగించి ఫిల్టర్ చేయబడింది.

ప్రయోగాత్మక సమూహాలు మరియు అధ్యయన రూపకల్పన

Male NMR mice were purchased from the Pasteur Institute Experimental Animal Center, Tehran, Iran. All animals were housed for one week before the experiments began in light- and temperature-regulated rooms at the traditional animal department of Alborz University of Medical Sciences.  All experimentations were permitted by the native ethical group (reference No Abzums.Rec.1395.51) and performed consistent with Animal Care and Use Protocol of Alborz University of Medical Sciences.

The animals were divided into two groups of young and old. Each group was then further subdivided into two groups (8 in each) including normal and colitis-induced. because the figure indicates, each of colitis-induced old or young groups was further subdivided into two subgroups, including colitis-induced with no treatment and colitis-induced treated with fKT. The study was performed in three phases. within the initiative , DSS-induced colitis was found out in young (2 months) and old (16 months) mice during a period of 21 days during which weight loss and therefore the clinical score were evaluated and compared with the age-matched healthy animals. within the second phase, the effect of fKT administration on survival analysis and therefore the clinical score were evaluated during a period of 21 days. After completion of phase I clinical trial and II of the study, molecular and histological evaluations were performed on young and old healthy controls, DSS-induced colitis, and DSS-induced colitis treated with fKT animals in phase III clinical trial . Considering the deathrate and clinical signs that occurred within the animals with colitis, animals at this phase of the study were sacrificed on day 14 after the start of the study.

Colitis induction

Colitis was induced on day 0 using administration of drinking water containing 3.5% (w/v) dextran sodium sulfate salt (DSS) (40000 kDa, MP Biomedical, Eschwege, Germany) per mouse per day. The animals and clinical signs of disease were daily monitored, indicated by weight loss, occurrence of blood in the stool or around the rectum, and diarrhea until day seven after the colitis induction. Weight loss was determined by comparing the body weight for each mouse to the baseline body weight and expressed as a percentage of weight loss. Other symptoms were scored according to the previously suggested system by Siegmund et al. Briefly, the different signs for stool consistency were scored as follows: score 0, well-formed pellets; score 2, pasty and semi-formed stools that did not adhere to the anus; score 4, liquid stools that did adhere to the anus. The different signs for bleeding were scored as follows: score 0, no blood measured using the Hemoccult system (Beckman Coulter); score 2, positive Hemoccult; score 4, gross bleeding. Animals with borderline scores were given a one-half score.

Histological and histopathological analysis

To perform histological evaluation of the colon, the animals were sacrificed under ether anesthesia after the last treatment with beverage or fKT. Colon was initially flushed with 1x ice-cold phosphate buffered saline (PBS) to get rid of feces completely. Tissue samples of the colon were then removed, fixed in 10% buffered formalin, and processed for paraffin sectioning. Sections of about 5 μm thickness were taken and stained with Hematoxylin and Eosin (H&E). The stained sections were examined with an Olympus cX41 microscope and photographed using an Olympus D330 camera . Damage score ranged from 0 to 4 scale was judged based on: inflammation represented by number and extent of leukocyte infiltration, epithelial defects represented by the severity of injury to the somatic cell layer, crypt atrophy estimated visually for the percent of atrophy within the crypts, edema, polymorphonuclear cells(PMNs) infiltration, and mucosal disruption.

Immunofluorescence studies of ZO-1 and ZO-2 expression

Sections of 5 µm paraffin-embedded colon tissues were prepared from each sample and then dewaxed, hydrated, and incubated in a protein block solution. Subsequently, the sections were incubated with the primary rabbit monoclonal ZO-1 or ZO-2 antibody (diluted 1:100 in 0.01 mol /L PBS; Zo-1: ab214228, Zo-2: ab2273, UK) followed by incubation with a goat anti-rabbit Alexa flour 488 (ab150077, Abcam, Cambridge shire, UK). The images were captured using a DeltaPix fluorescent microscope (Smorum, Denmark) and evaluated independently by two expert pathologists.

Analysis of gene expression by real-time PCR

Total RNA was extracted from ~50 mg of frozen colon tissue using guanidine/phenol solution (reagent lysis Qiazol-USA) consistent with the manufacturer’s instruction. the standard and quantity of RNA concentrations were monitored employing a NanoDrop 2000c (Eppendorf, Germany). Then, 1 μg RNA was reversely transcribed to DNA using Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Munich, Germany), consistent with the manufacturer’s instructions. The relative expression of mRNA for GAPDH, ZO-1, and ZO-2 decided by preparing reaction mixer with PCR Master Mix (2X) (Amplicon-Denmark) and gene-specific primers with diluted cDNA and final volume made up to 10 μl with nuclease-free water. Quantification and analysis were administered in ABI real-time PCR. The sequences of primers, designed by Integrated DNA Technologies, were forward 5′-TGTCCCACTTGAATCCCC-3′ and reverse 5′-TGTTTCCTCCATTGCTGTG-3′ for ZO-1 and forward 5′-CTCCCTCTTCACATCTGCTTC-3′ and reverse R: 5′-CTGTTACTTGCTTTGGTCTGG-3′ for ZO-2. The efficiencies for primers utilized in the study varied between 95% and 105%. Primer pairs were validated to make sure the right size of the PCR product and therefore the absence of primer dimers. The GAPDH gene was chosen as an indoor control against which mRNA expression of the target gene was normalized. The resultant organic phenomenon level was presented as 2-ΔCt, during which ΔCt was the difference between Ct values of the target gene and GAPDH.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using Graph Pad Prism 7.01. Data are presented as means± SD. ANOVA was wont to indicate any significant difference between the groups. Survival rates were illustrated using Kaplan–Meier plots and compared using the log-rank test. Value of P was considered statistically significant when it had been but 0.05.

Results:

Characteristics and clinical course of DSS-induced colitis

ఎలుకలలోని DSS-ప్రేరిత పెద్దప్రేగు శోథ అనేది పెద్దప్రేగు శోథ యొక్క వ్యాధికారకతను ఎదుర్కోవటానికి మరియు చికిత్సా విధానాలను అంచనా వేయడానికి సాధారణ జంతు నమూనా. ఈ నమూనా మా ప్రయోగశాలలో కనుగొనబడింది మరియు 21 రోజుల పాటు పర్యవేక్షించబడింది (దశ I). అలా చేయడానికి, మగ NMR ఎలుకలకు ఏడు రోజుల పాటు పానీయంలో 3.5% DSS ఇవ్వబడింది. జంతువుల మనుగడ రేటు, బరువు తగ్గడం మరియు రక్తస్రావం మరియు అతిసారంతో సహా పెద్దప్రేగు శోథ యొక్క క్లినికల్ సంకేతాల కోసం అధ్యయనం సమయంలో ప్రతిరోజూ తనిఖీ చేయబడుతుంది మరియు వయస్సు-సరిపోలిన ఆరోగ్యకరమైన జంతువులతో పోల్చబడింది. యువ DSS-చికిత్స పొందిన జంతువుల మనుగడ విశ్లేషణ 66% మరియు 33% జంతువులు వరుసగా 7 మరియు 14 రోజులలో సజీవంగా ఉన్నాయని మరియు ప్రతి ఒక్కటి 2వ రోజున చనిపోయాయని నిరూపించాయి. పాత DSS-చికిత్స పొందిన జంతువుల విషయంలో, మనుగడ 7 మరియు 14 రోజులలో 66% మరియు 50% జంతువులు సజీవంగా ఉన్నాయని విశ్లేషణ వెల్లడించింది మరియు ప్రతి ఒక్కటి 21వ రోజున చనిపోయాయి. వయస్సు-సరిపోలిన ఆరోగ్యకరమైన జంతువులతో పోలిస్తే DSS-చికిత్స పొందిన యువ మరియు వృద్ధ సమూహాలలో పెద్ద బరువు తగ్గడం. DSS- చికిత్స పొందిన యువ ఎలుకలు వరుసగా 7 మరియు 14 రోజులలో వాటి బరువులో సుమారు 10% మరియు 46% కోల్పోయాయి. DSS-చికిత్స పొందిన పాత ఎలుకలు వరుసగా 7 మరియు 14 రోజులలో వాటి బరువులో సుమారు 13.5% మరియు 15% కోల్పోయాయి. డైజెస్టివ్ డిజార్డర్ సంకేతాల విషయానికొస్తే, DSS పరిపాలన తర్వాత వరుసగా 2 మరియు మూడు రోజులలో DSS-చికిత్స పొందిన యువ మరియు వృద్ధ ఎలుకలలో రక్తస్రావం మరియు అతిసారం గమనించబడ్డాయి. DSS-చికిత్స పొందిన పాత ఎలుకల కంటే DSS- చికిత్స పొందిన యువ ఎలుకలు మరింత తీవ్రమైన క్లినికల్ సంకేతాలను మరియు తక్కువ మనుగడ రేటును చూపుతాయని ఈ ఫలితాలు చూపిస్తున్నాయి.

హిస్టోలాజికల్ పరిశీలనలు

అన్ని DSS-చాలెంజ్డ్ యువ మరియు ముసలి ఎలుకలలోని H&E-స్టెయిన్డ్ టిష్యూ విభాగాల యొక్క హిస్టోలాజికల్ విశ్లేషణ (Figure 6) వయస్సు-సరిపోలిన ఆరోగ్యకరమైన వాటితో పోలిస్తే PMNలు, క్రిప్టిక్ నష్టం, ఎపిథీలియల్ లోపం, శ్లేష్మ అంతరాయం, అపోప్టోసిస్, ఎడెమా మరియు శ్లేష్మ సన్నబడటం పెరిగిన చొరబాటును చూపించింది. ఎలుకలు. ఎఫ్‌కెటితో చికిత్స గాయం యొక్క పరిధిని తగ్గించింది, అయితే ఇది ఈ అధ్యయనం సమయంలో నిర్వహించబడిన నియమావళి ద్వారా ఆరోగ్యకరమైన స్థితికి పూర్తిగా తిరోగమనాన్ని కలిగించలేదు. ముఖ్యంగా, పాత ఆరోగ్యకరమైన ఎలుకలు పిఎమ్‌ఎన్‌లు, గుప్త నష్టం మరియు ఎడెమా యొక్క యువ, ఆరోగ్యకరమైన జంతువుల కంటే ఎక్కువ చొరబాటును కలిగి ఉన్నాయి. మూర్తి 6cలో చిత్రీకరించినట్లుగా, DSS అడ్మినిస్ట్రేషన్ ద్వారా శ్లేష్మ పొర మందం తగ్గింది ఎందుకంటే DSS-ప్రేరిత పెద్దప్రేగు శోథతో యువకులు మరియు పెద్దలలో క్లినికల్ స్కోర్ పెరిగింది. మార్చి 04-06, 2019న స్పెయిన్‌లోని బార్సిలోనాలో జరిగిన  క్లినికల్ న్యూట్రిషన్‌పై 24 ^వ అంతర్జాతీయ సదస్సులో ఈ పని పాక్షికంగా ప్రదర్శించబడింది .