బయోకెమిస్ట్రీ & అనలిటికల్ బయోకెమిస్ట్రీ

నైరూప్య

బయోటెక్నాలజీ కాంగ్రెస్ 2015 : ఫెడ్-బ్యాచ్ ప్రక్రియలలో రసాయనికంగా సవరించిన సిస్టీన్ మరియు CHO నిర్దిష్ట ఉత్పాదకతపై ప్రభావం - అలైన్ జిమ్మెర్ మెర్క్ మిల్లిపోర్

అలైన్ జిమ్మెర్

మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీస్ వంటి చికిత్సా ప్రోటీన్ల ఉత్పత్తికి క్షీరద కణాల పారిశ్రామిక ఫెడ్-బ్యాచ్ పెంపకం ఉపయోగించబడుతుంది. ప్రాథమిక వృద్ధిని నిర్ధారించే మాధ్యమంతో పాటు, పెరుగుదల, సాధ్యత మరియు యాంటీబాడీ ఉత్పత్తిని మెరుగుపరచడానికి దాణా అవసరం. స్థాపించబడిన వాణిజ్య వ్యవస్థలలో కొద్దిగా ఆమ్ల సాంద్రీకృత ప్రధాన ఫీడ్ మరియు L-టైరోసిన్ మరియు L-సిస్టీన్ కలిగిన ప్రత్యేక ఆల్కలీన్ అమైనో ఆమ్లం ఫీడ్ ఉన్నాయి. గాలి మరియు లోహ ఉత్ప్రేరకాల సమక్షంలో సిస్టీన్‌కు డైమెరైజేషన్ చేయడం వల్ల L-సిస్టీన్ స్థిరంగా ఉండదు కాబట్టి, తటస్థ pH ఫీడ్‌లలో అన్ని అమైనో ఆమ్లాలను చేర్చడానికి స్థిరమైన L-సిస్టీన్ ఉత్పన్నం అవసరం. ఆ సింగిల్ ఫీడ్ సిస్టమ్‌లు ఫీడింగ్ స్కీమ్‌లను సులభతరం చేయడానికి మరియు pH మరియు DO సిగ్నల్స్ రెండింటిని స్థిరీకరించడం ద్వారా మొత్తం ప్రక్రియ పటిష్టతను మెరుగుపరచడానికి అనుకూలంగా ఉంటాయి. ఇక్కడ, పారిశ్రామిక సింగిల్ ఫీడ్-బ్యాచ్ ప్రక్రియలో ఫాస్ఫర్ టైరోసిన్ డిసోడియం ఉప్పుతో కలిపి రసాయనికంగా సవరించిన సిస్టీన్‌ను ఉపయోగించాలని మేము సూచిస్తున్నాము, ఇది చిన్న స్థాయిలో మరియు బయోఇయాక్టర్‌లలో వర్తిస్తుంది. మానవ మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీని వ్యక్తీకరించే CHO సస్పెన్షన్ సెల్ లైన్‌తో స్పిన్ ట్యూబ్‌లు లేదా బయోఇయాక్టర్‌లలో సెల్ కల్చర్ ప్రయోగాలు జరిగాయి. ఆటోమేటిక్ సెల్ లెక్కింపు పరికరాన్ని ఉపయోగించి ఆచరణీయ సెల్ సాంద్రత మరియు సాధ్యత కొలుస్తారు. ప్రీ-కాలమ్ డెరివేటైజేషన్ మరియు UPLC విశ్లేషణ తర్వాత అమైనో ఆమ్లాల కోసం మరియు LC-MS/MS ఉపయోగించి విటమిన్‌ల కోసం సూపర్‌నాటెంట్‌ల స్పెంట్ మీడియా విశ్లేషణ జరిగింది.

ఫోటోమెట్రిక్ మరియు టర్బిడోమెట్రిక్ పద్ధతులపై ఆధారపడి సెడెక్స్ బయో హెచ్‌టితో మెటాబోలైట్ కొలతలు జరిగాయి. గ్లైకాన్ విశ్లేషణల కోసం 2-AB లేబులింగ్, ఛార్జ్ వేరియంట్ విశ్లేషణల కోసం cIEF మరియు పెప్టైడ్ మ్యాపింగ్ ప్రయోగాల కోసం LC-MS/MS ఉపయోగించి మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ యొక్క లక్షణం ప్రదర్శించబడింది. సవరించిన సిస్టీన్ ఉత్పన్నాన్ని కలిగి ఉన్న ఫీడ్ యొక్క స్థిరత్వ అధ్యయనాలు అణువు స్థిరంగా ఉందని మరియు గది ఉష్ణోగ్రత లేదా 4 °C వద్ద నిల్వ చేసినప్పుడు మూడు నెలల పాటు L-సిస్టీన్ లేదా L-సిస్టైన్ విడుదల చేయబడలేదని తేలింది. అంతేకాకుండా, కాలక్రమేణా ఫీడ్ యొక్క రంగులో ఎటువంటి మార్పు కనిపించలేదు. చిన్న తరహా బ్యాచ్ ప్రయోగాలు L-సిస్టీన్ స్థానంలో అదే మొత్తంలో రసాయనికంగా సవరించబడిన సిస్టీన్‌తో వృద్ధి లేదా సాధ్యత ప్రొఫైల్‌లలో ఎటువంటి మార్పు లేదని సూచించింది. చిన్న స్థాయి ఫెడ్-బ్యాచ్ ప్రక్రియలలో సవరించిన సిస్టీన్ ఉత్పన్నం యొక్క ఉపయోగం పోల్చదగిన గరిష్ట ఆచరణీయ సెల్ సాంద్రత, దీర్ఘకాల సాధ్యత మరియు స్థాపించబడిన రెండు ఫీడ్ సిస్టమ్‌తో పోలిస్తే పెరిగిన టైటర్‌ను సూచించింది.

ఒకే ఫీడ్ వ్యూహాన్ని రెండు ఫీడ్ వ్యూహంతో పోల్చినప్పుడు చిన్న స్థాయిలో వివరించిన నిర్దిష్ట ఉత్పాదకత పెరుగుదలను బయోఇయాక్టర్ ప్రయోగాలు నిర్ధారించాయి. మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ యొక్క డెప్త్ క్యారెక్టరైజేషన్‌లో గ్లైకోసైలేషన్ లేదా ఛార్జ్ వేరియంట్ నమూనాలో ఎటువంటి మార్పు లేదని సూచించింది, అయితే పెప్టైడ్ మ్యాపింగ్ ప్రయోగాలు మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీ క్రమంలో సవరించిన అమైనో ఆమ్లం యొక్క ఏ విధమైన ఏకీకరణను గుర్తించలేకపోయాయి. మోనోక్లోనల్ న్యూట్రలైజర్ (mAb) సృష్టి కోసం క్షీరదాలు క్లంప్ ఫారమ్‌లను జాగ్రత్తగా చూసుకున్నారు, ఉదాహరణకు, గ్లూకోజ్, పోషకాలు మరియు అమైనో ఆమ్లాలు సంస్కృతి సమయాన్ని విస్తరించడానికి మరియు ప్రోటీన్ ఉత్పత్తిని మెరుగుపరచడానికి[1].వాస్తవ విధానాలలో, L- సిస్టీన్ మరియు ఎల్-టైరోసిన్ నిష్పాక్షికంగా తక్కువ స్థిరత్వం మరియు తక్కువ సాల్వెన్సీ కారణంగా కరిగే pH వద్ద స్వతంత్రంగా జాగ్రత్త తీసుకోబడతాయి. pH, pH టాప్స్ మరియు అవక్షేపాలను తీసుకువస్తుంది[2]. అత్యాధునిక రూపాలను మెరుగుపరచడానికి, రెండు అమైనో ఆమ్లాలు వాటి నిర్దిష్ట ఘనత మరియు కరిగిపోయే ప్రొఫైల్‌లను అప్‌గ్రేడ్ చేయడానికి కృత్రిమంగా మార్చబడ్డాయి. ఫాస్ఫోటైరోసిన్ డిసోడియం సాల్ట్ (PTyr2Na) ఒక స్థిరమైన L-టైరోసిన్ సబార్డినేట్ అని మరియు నిష్పాక్షికమైన pHలో ఉపయోగించబడుతుందని గత పని ప్రదర్శించింది, ఇది జీవిత అమలు విధానం లేదా mAb నాణ్యత లక్షణాలను గుర్తించదగిన విధంగా ప్రభావితం చేయకుండా జాగ్రత్త తీసుకుంటుంది[3]. ఇక్కడ, మేము L-సిస్టీన్ అనుబంధ సంస్థను నిష్పక్షపాతంగా pH, సింగిల్-ఫీడ్ ఫ్రేమ్‌వర్క్‌లో ఉపయోగించడం ద్వారా ఫలితాలను అందిస్తున్నాము.

L-సిస్టీన్ అనుబంధ సంస్థ యొక్క విశ్వసనీయత పక్షపాతం లేని pH, CellventoTM Feed-220లో ఒక సంవత్సరం క్వార్టర్ ఉష్ణోగ్రత వద్ద లేదా 4 °C వద్ద అంచనా వేయబడింది. సమూహ సమాజాల సంరక్షణ కోసం, మానవ mAbని కమ్యూనికేట్ చేసే CHO K1 క్లోన్ ఉపయోగించబడింది. ఐటెమ్ ప్రొసీజర్ డైరెక్షన్ ద్వారా సూచించిన విధంగా Cellvento™ CHO-220 మీడియా ఫ్రేమ్‌వర్క్‌లో అభివృద్ధి జరిగింది. నియంత్రణల కోసం, సెల్‌వెంటో™ ఫీడ్-220 మరియు విభిన్న ప్రాథమిక సిస్టీన్/టైరోసిన్ ఫీడ్‌లు ఉపయోగించబడ్డాయి, అయితే సింగిల్ ఫీడ్ ప్రక్రియలో, L-సిస్టీన్ అనుబంధ సంస్థ మరియు PTyr2Na నిష్పాక్షికమైన pH, ప్రైమరీ ఫీడ్‌లో చట్టబద్ధంగా కరిగించబడ్డాయి. ట్రయల్స్ టర్న్ ట్యూబ్‌లు మరియు 1.2L బయోఇయాక్టర్‌లలో పనిచేశాయి. ViCell®ని ఉపయోగించడం ద్వారా అభివృద్ధి మరియు సహేతుకత గమనించబడింది, సెడెక్స్ బయో హెచ్‌టిని ఉపయోగించి టైటర్ పరిష్కరించబడింది మరియు టైటర్, కీలకమైన సెల్ మందం మరియు బలహీనతపై ఆధారపడి స్పష్టమైన లాభదాయకత నిర్ణయించబడుతుంది.

ఖర్చు చేసిన మీడియా పరిశోధన కోసం, UPLCUsing AccQ·TagTMUltra Reagent ద్వారా L-సిస్టీన్ అనుబంధ సంస్థ మరియు అమైనో తినివేయు కొలత నిర్వహించబడింది. ఫీడ్ యొక్క ప్రతిస్పందించే సామర్థ్యాన్ని అంచనా వేయడానికి, H2DCFDA నిష్పక్షపాత pHకి జోడించబడింది, Cellvento™ Feed-220 మెరుగుపరచబడింది లేదా సబార్డినేట్‌తో కాదు. కణాంతర ప్రతిస్పందించే జాతుల మూల్యాంకనం కోసం, కణాలు కార్బాక్సీ-H2DCFDAతో గుర్తించబడ్డాయి మరియు ఫ్లోరోసెన్స్ అంచనా వేయబడింది. అనుబంధాన్ని ఉపయోగించడానికి కణాల పరిమితిని అంచనా వేయడానికి, సెల్ లైసేట్‌లు స్పైక్ చేయబడ్డాయి మరియు UPLC ద్వారా ఆకారపు అంశాలు మూల్యాంకనం చేయబడ్డాయి. mAb పరీక్ష కోసం, 2-AB మార్కింగ్ తర్వాత HPLCని ఉపయోగించి N-గ్లైకోసైలేషన్ కొలుస్తారు, అయితే cIEF ఉపయోగించి ఛార్జ్ వైవిధ్యాలు పరిష్కరించబడ్డాయి.

నిష్పాక్షికమైన pH ఫీడ్‌లో L-సిస్టీన్ అనుబంధ స్థిరత్వం యొక్క పరిశోధనలో సబార్డినేట్ ఫిక్సేషన్‌లో లేదా L-సిస్టీన్/L-సిస్టైన్ డిశ్చార్జ్‌లో ఎటువంటి సర్దుబాటు జరగలేదని, గది ఉష్ణోగ్రత లేదా 4°C వద్ద ఏడాదిలో పావు వంతు కంటే ఎక్కువ దూరంగా ఉంచినప్పుడు. ప్రయత్నించిన పరిస్థితుల్లో సబార్డినేట్ స్థిరంగా ఉన్నట్లు చూపే అవపాతం లేదా షేడింగ్ మార్పు చూడబడలేదు. సింగిల్-ఫీడ్ విధానంతో టర్న్ ట్యూబ్‌లలో బంచ్ డెవలప్‌మెంట్‌ను జాగ్రత్తగా చూసుకుంటే, కంట్రోల్ కండిషన్‌తో విభేదించినప్పుడు చివరి టైటర్‌లను అప్‌గ్రేడ్ చేయడం ద్వారా అధిక లాస్ట్ ఎబిబిలిటీలను తీసుకువచ్చింది. సింగిల్ ఫీడ్ మెథడాలజీతో అధిక చివరి సాధ్యత, విస్తరించిన టైటర్‌లు మరియు అధిక స్పష్టమైన లాభదాయకతను ప్రేరేపించే బయోఇయాక్టర్‌లలో టర్న్ ట్యూబ్ ఫలితాలు ధృవీకరించబడ్డాయి.

H2DCFDA నిష్పాక్షికమైన pHకి విస్తరించిన తర్వాత తక్కువ రంగు ఆక్సీకరణ అంచనా వేయబడింది, Cellvento™ Feed-220 సబార్డినేట్‌ను కలిగి ఉన్న ఫీడ్‌తో మాత్రమే తక్కువ గ్రాహక సామర్థ్యాన్ని చూపుతుంది. కార్బాక్సీ-H2DCFDA యొక్క విస్తరణ ద్వారా దిగువ కణాంతర రంగు ఆక్సీకరణ గుర్తించబడింది, ట్యూబ్ సింగిల్-ఫీడ్‌ను మార్చడం ద్వారా సబార్డినేట్‌ను ఉపయోగించినప్పుడు తక్కువ కణాంతర గ్రహణ జాతుల వయస్సును చూపించే బంచ్ సొసైటీలను జాగ్రత్తగా చూసుకుంది. సెల్ లైసేట్‌లుగా స్పైక్ చేయబడినప్పుడు, సిస్టీన్ సబార్డినేట్ సిస్టీన్‌కు ఉపయోగించబడింది. అందించిన mAbలో N-గ్లైకోసైలేషన్ లేదా ఛార్జ్ వైవిధ్యంలో ఎటువంటి భేదం గుర్తించబడలేదు, ప్రవేశపెట్టిన ప్రాథమిక నాణ్యత లక్షణాలపై అనుబంధ సంస్థ ప్రభావం చూపలేదు. ఈ పరీక్షలో L-సిస్టీన్ అనుబంధ సంస్థ మరియు PTyr2Na పక్షపాతం లేని pHలో చేర్చబడవచ్చని చూపిస్తుంది మరియు క్లస్టర్ ఫారమ్‌లను జాగ్రత్తగా చూసుకోవడంలో L-సిస్టీన్ యొక్క వెల్‌స్ప్రింగ్‌గా ఉపయోగించవచ్చు, ఇది తరగతి ప్రక్రియలో ఉత్తమమైన వాటితో పోలిస్తే అధిక స్పష్టమైన సామర్థ్యాన్ని ప్రోత్సహిస్తుంది. mAb ప్రాథమిక నాణ్యత లక్షణాలను ప్రభావితం చేయకుండా.